1. 背景介紹
近年來，質(zhì)量源于設計(QBD)和過程分析技術(PAT)的概念被廣泛接受并應用于評估過程的穩(wěn)健性，監(jiān)控和改進過程開發(fā)和藥品生產(chǎn)。PAT技術，特別是在線和實時監(jiān)測技術，在開發(fā)可靠的新工藝以生產(chǎn)具有期望質(zhì)量特性的產(chǎn)品方面顯示出巨大的潛力。它還可以通過實現(xiàn)方便、實質(zhì)和連續(xù)的測量，從而增強傳統(tǒng)的離線分析，幫助進一步了解該過程。
近紅外(NIR)、中紅外(MIR)、拉曼光譜(Raman)和熒光光譜(Fluorescent)等光譜分析方法在生物過程監(jiān)測和控制方面取得了進展。近幾十年來，拉曼光譜技術以其化學特異性高、受水干擾小等優(yōu)點，在生物制藥領域受到越來越多的關注。拉曼光譜的應用有助于實現(xiàn)原位測量，使實時過程控制成為一種可期的PAT工具。然而，拉曼光譜是否可以用于灌流細胞培養(yǎng)以自動控制VCD還沒有研究。
在灌流細胞培養(yǎng)生物反應器中，交替切向流(ATF)系統(tǒng)是一種穩(wěn)健且可擴展的過濾系統(tǒng)，它使用中空纖維膜和交替切向流以相對低的剪切力實現(xiàn)高效的細胞保留。在生物反應器中保存細胞的同時，提取含有抗體和乳酸、銨等栓塞物質(zhì)的細胞培養(yǎng)液?；罴毎芏?VCD)和總細胞密度(TCD)通常被設定為細胞培養(yǎng)過程中的關鍵性能參數(shù)，對VCD和TCD的監(jiān)測對于確定培養(yǎng)階段和異常事件具有極其重要的意義。在灌流細胞培養(yǎng)中保持適當?shù)幕罴毎芏群涂偧毎芏扔欣诩毎麪顟B(tài)，有助于降低由交替切向流(ATF)膜污染引起的產(chǎn)物滯留，并產(chǎn)生高生產(chǎn)率。目前，生物量探針還可以在線測量細胞培養(yǎng)過程中的VCD和TCD。許多研究人員證明生物量探測器可以幫助他們監(jiān)控VCD的實時變化，從而幫助他們開發(fā)出更穩(wěn)健的工藝。然而，細胞培養(yǎng)過程非常復雜，細胞的生長、代謝、生化和生產(chǎn)率以及產(chǎn)品質(zhì)量都對制造業(yè)的成功具有重要意義。拉曼光譜使傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)過程只需一個探針就能實時監(jiān)測甚至控制許多參數(shù)，大大簡化了PAT的復雜性。
Abu-Absi等人于2011年報道了原位拉曼測量結果。他們借助拉曼光譜和偏最小二乘(PLS)模型，在500L生物反應器的規(guī)模上成功地在線測量了葡萄糖、谷氨酸、銨離子、乳酸的濃度以及活細胞密度(VCD)和總細胞密度(TCD)。此外，他們還提出了基于拉曼光譜的過程開發(fā)的即時反饋策略的可能性。證明了這些參數(shù)的校準模型可以從3L擴展到15L。2014年，Berry等人基于在5L生物反應器中校準的Raman模型，通過在200L和2000L中的跨尺度預測，表明VCD和TCD的模型具有尺度依賴性。其他代謝物，如葡萄糖，乳酸和滲透壓模型顯示了跨尺度預測的巨大性能。為了進一步證明拉曼光譜的準確性，他們創(chuàng)建了第一個基于拉曼的葡萄糖濃度反饋控制和乳酸回路控制模式。此外，利用拉曼光譜儀對抗體滴度進行原位和實時監(jiān)測的應用于2015年得到證實。André等人[14]基于拉曼光譜實時監(jiān)測抗體效價濃度。他們相信這種方法可以為建立以實時監(jiān)測和控制的方式優(yōu)化重組抗體生產(chǎn)的反饋回路奠定基礎。
拉曼技術在預測細胞培養(yǎng)階段的純度方面也顯示出巨大的潛力，Ashton等人在2014年展示了紫外共振拉曼(UVRR)光譜在蛋白質(zhì)純化澄清步驟前后監(jiān)測可能污染細胞培養(yǎng)基的殘余DNA和RNA變化的潛力。Singh等人利用拉曼光譜和CLS算法在細胞分批培養(yǎng)中高精度地測定葡萄糖和乳酸，同時他們還為定義明確的化學物質(zhì)建立了一個自制的拉曼光譜庫。
近年來，拉曼光譜儀作為一種實驗室和工業(yè)規(guī)模的可靠的PAT工具被廣泛應用于細胞培養(yǎng)中。Liu等人利用相關優(yōu)化彎曲(COW)方法對正常工作條件(NOC)批次的不同時間間隔的拉曼數(shù)據(jù)集進行同步，建立了多元統(tǒng)計過程控制(MSPC)模型，該模型能夠識別生物反應器是否受到污染等異常工況。Santos等人在2018年開發(fā)了一種新的代謝物建模策略，利用樣本打擊方法。作者嘗試將指紋拉曼光譜區(qū)域分配和成分尖峰研究結合起來，以提高模型預測能力和特異性。比較了前向區(qū)間偏最小二乘(iPLS)、PLS投影變量重要性(V.I.P)和選擇比(SR)三種數(shù)據(jù)分析方法對模型參數(shù)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)iPLS和V.I.P在模型預測性能上更具前景。
灌流細胞培養(yǎng)作為一種連續(xù)過程的策略，近年來得到了廣泛的應用，并因其較高的產(chǎn)品收率和穩(wěn)定的PQA而受到廣泛關注。ATF裝置可去除抑制性副產(chǎn)物，如乳酸、銨、溶解二氧化碳和其他副產(chǎn)物的積累，同時不斷添加新鮮營養(yǎng)素。采用灌流策略，在小型生物反應器中可以獲得更高的細胞數(shù)和產(chǎn)量。與補料相比，灌流時細胞密度高達2.14×108個細胞/mL，產(chǎn)品效價高達25g/L。通常，灌流過程通過引入細胞流出來維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，從而在特定的靶細胞密度下進行，同時，由于產(chǎn)品保留時間較短，因此保持了重組蛋白的穩(wěn)定性和質(zhì)量。
在最近的FDA關于連續(xù)生產(chǎn)的指導意見中，強調(diào)了產(chǎn)品質(zhì)量問題，該指導意見建議應用過程監(jiān)控和使用PAT工具，以幫助生成有關于輸入物料、過程中物料和最終產(chǎn)品的過程參數(shù)和屬性的實時信息，這將為高檢測能力的瞬時干擾、過程偏差、動態(tài)過程控制、更準確的物料偏移和實時放行測試(RTRT)照亮道路。因此，F(xiàn)DA希望通過QbD和PAT等增強型開發(fā)方法對藥品生產(chǎn)進行連續(xù)化生產(chǎn)，以減少藥品質(zhì)量問題，降低生產(chǎn)成本。然而，由于灌流設備的復雜性和無菌性的挑戰(zhàn)，在灌流細胞培養(yǎng)過程中很少使用原位和實時監(jiān)測PAT工具。到目前為止，大多數(shù)灌注細胞培養(yǎng)仍然依賴于傳統(tǒng)的人工取樣和離線/近線測量，這可能導致離線采樣后很長時間的延遲，使得必要時很難采取糾正措施，增加了批風險。此外，人工取樣會帶來更多可能導致污染的人為錯誤風險。因此，在灌流細胞培養(yǎng)中應用拉曼光譜等PAT工具勢在必行。
此研究首先采用拉曼光譜法對葡萄糖、乳酸、銨離子、鈉離子、鉀離子等代謝物在灌注流細胞培養(yǎng)中的預測能力進行了評價。比較了幾種活細胞密度(VCD)的建模方法，選擇了最佳的拉曼反饋控制方法。建立了灌流細胞培養(yǎng)-拉曼集成系統(tǒng)，成功地進行了11天的VCD在線自動控制。
2. 方法
2.1 材料
生物過程控制器系統(tǒng)：Finesse G3實驗室通用控制器、TruBio Delta V 5.0控制軟件、3L Applikon玻璃生物反應器。ATF系統(tǒng)：Repligen交替切向流(ATF，Repligen，Pine Brook，NJ)系統(tǒng)，其中中空纖維模塊由孔徑為0.22μm的聚醚砜(PES)組成、 纖維直徑為1 mm，過濾器尺寸為0.47 m2。拉曼系統(tǒng)：Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼分析儀(Kaiser Optical Systems，Inc.，Ann Arbor，MI)，激光激發(fā)波長785nm，最多四個bIO LAB-220探針。采用SIMCA14.1.2軟件進行建模。OPC連接系統(tǒng)：Raman RunTime中的嵌入式OPC服務器，MatrikonOPC數(shù)據(jù)管理軟件(MatrikonOPC，加拿大艾伯塔省埃德蒙頓)。細胞系和培養(yǎng)基：表達人IgG1單克隆抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，商業(yè)化成分明確的基礎和補料培養(yǎng)基。
2.2 細胞培養(yǎng)
采用3LApplikon臺式生物反應器(工作體積為1500ml)灌流培養(yǎng)產(chǎn)IgG1單克隆抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，采用商品化的基礎培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基進行灌流。生物反應器的運行溫度為34.5℃。在整個培養(yǎng)過程中pH和DO保持穩(wěn)定。攪拌設定為250 RPM。
生物反應器的接種密度約為0.5× 106細胞/mL。第2天VCD達到約2.0× 106時開始基礎培養(yǎng)基灌注，VCD大于50× 106細胞/mL時開始流加補料。細胞在兩個3L生物反應器中采用相同的灌流培養(yǎng)方式和培養(yǎng)技術進行培養(yǎng)，反應器控制器標記為FC0A和FC0B進行區(qū)別。
使用ATF2細胞保留系統(tǒng)和聚醚砜過濾器(孔徑：0.2μm)進行灌注培養(yǎng)、 膜面積：0.47 m2。對于基礎培養(yǎng)基補料，灌流率在0.6到1.5新鮮培養(yǎng)基體積/生物反應器每天工作體積(VVD)之間變化。對于補料培養(yǎng)基，灌流速率在0.2～0.4VVD之間，以14.4min的間隔進行半連續(xù)補加，細胞流加通過精細控制器控制的蠕動泵進行。
這兩個生物反應器每天進行兩次無菌取樣，進行離線分析，然后用于建模。取樣后，約2ml無菌細胞培養(yǎng)液樣品直接送血氣分析儀(RAPIDLab® 348EX BGA，Siemens)，用于pH、pCO2、pO2、Na+、k+測量。用Vi-CELL(Vi-CELL，BECKMAN)測定細胞密度、活力和細胞直徑。葡萄糖，谷氨酰胺，谷氨酸，用Cedex(Cedex-Bio-HT，Roche)測定乳酸、NH4+和效價。通過滲透壓計(Model 2020，Advanced Instruments)測量滲透壓。
2.3拉曼光譜的獲得
在線拉曼測量由Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼分析儀(Kaiser Optical Systems，Inc.，Ann Arbor，MI)進行，激光激發(fā)波長為785nm。一個拉曼分析儀支持多達4個探針，因此它能夠監(jiān)測多達4個探頭。因此它能夠?qū)IO-LAB-220探針浸入3L臺式Applikon玻璃生物反應器中，同時檢測多達4個生物反應器。還使用了典型的200mw激光功率。每條拉曼光譜都是用10秒的曝光時間和75次積累收集的。采集模式是連續(xù)的。也采用了暗光譜減法和宇宙射線濾波器。每個光譜總共用了大約13分鐘來獲得。分析儀在使用前進行校準，每天進行一次自動校準，以確保整個細胞培養(yǎng)過程中波長的準確性。
2.4化學計量學模型
收集的拉曼光譜與離線進行的各種標準測量相關。光譜和測量的生化數(shù)據(jù)使用Umetrics的SIMCA14.1.2進行分析和處理。首先利用光譜濾波模塊對校準光譜進行預處理，然后用偏最小二乘(PLS)回歸方法將校準光譜與標準樣品進行關聯(lián)。對于用于拉曼光譜的PLS模型，它是一個一般的線性回歸模型，通過將預測變量(VCD、葡萄糖、乳酸……)和可觀測變量(不同拉曼位移下的拉曼強度)投影到一個新的空間，PLS模型的主要參數(shù)是加載矩陣和殘差矩陣。在建模過程中，參數(shù)由觀測到的y變量及其對應的x變量擬合而成。通過減小預測Y與實測Y之間的誤差，自動獲得參數(shù)。
影響模型質(zhì)量的主要因素是拉曼光譜數(shù)據(jù)的預處理方法和x-block的選取。如圖3所示，對于不同的目標(Y)，基于統(tǒng)計性能，選擇拉曼數(shù)據(jù)預處理方法和x-block范圍，即Y中的交叉驗證均方根誤差(RMSECV)(公式1)圖片(1)，其中n等于樣本數(shù)，i等于當前樣本，yi是測量參數(shù)，圖片是預測參數(shù)。對于交叉驗證，使用交叉驗證計算測試/訓練集的RMSE。以RMSECV最佳的模型作為最終的代謝物預測模型。
對拉曼光譜數(shù)據(jù)進行適當?shù)念A處理對于建立一個性能良好的模型非常重要。本研究中常用的預處理方法是標準正態(tài)變量(SNV)和導數(shù)，這些方法用于歸一化輪廓、減小信號基線偏移、減小瑞利散射和背景噪聲的影響。根據(jù)統(tǒng)計模型性能(RMSECV)，選擇一階或二階導數(shù)濾波器對不同的相關參數(shù)進行建模。對于光譜區(qū)域的選擇，重要的是去除主要由噪聲、偽影、瑞利散射或其他非拉曼特征組成的光譜區(qū)域。一般建模僅限于拉曼光譜的指紋區(qū)域或根據(jù)V.I.P指數(shù)進行選擇。在本研究中，常用的x-block范圍為800–1800 cm-1或800-3400cm-1、投影指標(V.I.P)的變量重要性也是統(tǒng)計上細化x-block組選擇的指標。通常建立多個模型，由最小RMSECV選擇優(yōu)模型。
經(jīng)過預處理和光譜區(qū)域選擇，建立了葡萄糖、乳酸、NH4+和活細胞密度(VCD)等的獨立PLS模型。通過顯示交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和預測均方根(RMSEP)的觀察圖和預測圖對模型結果進行評估。另一個重要的診斷工具，即Hotelling的T2圖，可以用來理解模型的超結構和檢測異常值。
2.5 拉曼光譜與生物過程控制器的集成
Raman運行時系統(tǒng)提供嵌入式OPC-UA服務器。Finesse Trubio配有OPC DA服務器，因此可以通過MatrikonOPC數(shù)據(jù)管理器獲得預測值。集成和反饋控制回路如圖1所示。如圖1所示，該控制策略存在兩個邏輯回路。第一種稱為過程控制回路，在3L生物反應器中以恒定的頻率獲得拉曼信號，然后將其傳輸?shù)街鳈C，即運行時系統(tǒng)，主機中的SimcaKaiser模塊讀取光譜文件并將其轉換為預測值，然后這些值通過本地網(wǎng)絡傳輸?shù)組atrikonOPC數(shù)據(jù)管理器，最終Finesse TruBio DeltaV系統(tǒng)讀取這些值并啟動我們自定義的VCD自動排放邏輯，該邏輯回路實現(xiàn)VCD的在線自動控制。第二個是建模循環(huán)，一旦需要建立一個新模型，就必須啟動這個循環(huán)。
2.6 VCD自動反饋控制
穩(wěn)定灌流培養(yǎng)的目標VCD設置為50×106個活細胞/mL。當VCD自動控制啟動，在線VCD增加到目標VCD以上時，控制邏輯觸發(fā)工作。將目標VCD與Raman在線VCD之間的誤差引入P.I.D算法中，將泵速級聯(lián)，并與PID算法的輸出成比例。為了保證自動控制過程的穩(wěn)健性，一旦在線和離線測量VCD的差值大于5×106個活細胞/m，意味著預測的VCD將失去其準確性，將最新的數(shù)據(jù)加入到VCD的PLS模型的數(shù)據(jù)集中，以提高模型的準確性。
3. 結果
3.1 灌流細胞培養(yǎng)的拉曼光譜
一次灌注實驗的拉曼光譜原始數(shù)據(jù)如圖2所示，其中y軸表示拉曼強度，x軸表示從100 cm-1開始的拉曼位移至3400cm-1。圖中的每一行代表一條拉曼曲線，此時的顏色表示測得的活細胞密度(VCD)。
3.2 灌流細胞培養(yǎng)關鍵生化指標的預測
為了驗證利用拉曼光譜監(jiān)測灌注細胞培養(yǎng)的關鍵生化指標，即IgG濃度、細胞活力、谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、乳酸、NH4+、滲透壓、Na+、K+和pCO2的可能性，根據(jù)FC0A的數(shù)據(jù)建立了各種PLS模型。它們在測試集(FC0B)上的性能如圖3所示。
如圖3和表1所示，IgG的PLS模型，可接受的預測RMSEP為147.48 mg/L，誤差主要歸因于ATF柱的產(chǎn)物保留率隨時間變化。與Li等人對補料分批培養(yǎng)的良好細胞活力預測(平均誤差：2.5%)相比，我們的細胞活力預測模型在灌流培養(yǎng)中沒有這么好的表現(xiàn)。細胞存活率的預測結果不令人滿意，RMSEP為39%，這表明細胞存活率不僅受細胞密度、細胞代謝狀況或外界環(huán)境的影響，而且與基礎補加速率、排放速率密切相關，因此需要進一步的工作來優(yōu)化模型。考慮到這些PLS模型只在一個批次內(nèi)進行了校準，并且在灌流培養(yǎng)模式下預測更具挑戰(zhàn)性，對于谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖和乳酸等溶質(zhì)，在測試集上的預測性能是可以接受的。
值得注意的是，從第26天到第45天谷氨酸的預測偏差可能是由于模型擬合不足和批次間的差異造成的。模型對第1天到第19天的葡萄糖濃度進行了準確的預測，但第19天以后隨著生物反應器中葡萄糖濃度逐漸下降到0，表現(xiàn)為葡萄糖進料、出料和消耗的動態(tài)平衡。我們推測培養(yǎng)基的異質(zhì)性導致了葡萄糖濃度預測誤差的增加。與補料分批模式下的葡萄糖預測相比，葡萄糖預測更具挑戰(zhàn)性，尤其是在表觀葡萄糖濃度幾乎保持不變的穩(wěn)定階段。
拉曼光譜對NH4+、Na+、K+也有很好的結果。由于FC0A(訓練集)和FC0B(測試集)的累積差異隨著培養(yǎng)時間的延長而增大，預測的K+濃度在后期略有漂移。在滲透壓方面表現(xiàn)良好，RMSEP為5mosmo/kg，這意味著可以準確預測滲透壓。同時，拉曼光譜也顯示了預測灌流培養(yǎng)時生物反應器中pCO2的潛力。
3.3. 活細胞密度模型
為了實現(xiàn)VCD的自動控制，獲得一個穩(wěn)健、準確的PLS預測模型是非常重要的。對VCD的實時準確預測有助于控制器在過程在線控制回路中做出快速、正確的響應。因此，比較了6種不同的拉曼信號預處理方法和數(shù)據(jù)源模型，即2種導數(shù)模型和3種數(shù)據(jù)源模型。數(shù)據(jù)源的變化會給模型的標定空間帶來很大的差異，導致VCD預測模型性能的不同?？紤]到生物反應器FC0A是為VCD自動控制而設計的，因此VCD建模考慮的第一個數(shù)據(jù)源是FC0A中的歷史拉曼數(shù)據(jù)，這意味著根據(jù)FC0A從第1天到第50天的歷史數(shù)據(jù)預測第51天的VCD。第二個數(shù)據(jù)源來自并聯(lián)的生物反應器FC0B。訓練模型的第三個數(shù)據(jù)源是來自FC0B和FC0A(第1-50天)的培養(yǎng)數(shù)據(jù)。
如圖4所示，所有6個PLS模型在訓練集上都具有可接受的預測性能，特別是對于基于拉曼光譜的一階導數(shù)模型(左側)。同時，針對不同數(shù)據(jù)源的模型，將數(shù)據(jù)點分布在不同的范圍內(nèi)。更詳細地說，F(xiàn)C0A第1-50天的訓練數(shù)據(jù)具有更均勻的VCD數(shù)據(jù)分布，而FC0B的訓練數(shù)據(jù)具有更多位于VCD 45-60范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點×106細胞/mL。
如圖5所示，一般情況下，一階導數(shù)訓練集的RMSECV(交叉驗證均方根誤差)低于二階導數(shù)的RMSE。并從Hotelling的T-range2值方面對兩種導數(shù)方法進行了比較。如圖6(a)所示，對于一階導數(shù)建立的模型，有些點超過了95%的置信限，說明一階導數(shù)預處理會影響模型的質(zhì)量。因此，從Hotelling的T2-range圖來看，二階導數(shù)預處理優(yōu)于一階導數(shù)預處理。
以下是不同型號的VCD的性能測試結果。如圖7和圖8所示結果表明，由于數(shù)據(jù)預處理方法和數(shù)據(jù)來源的不同，預測VCD的PLS模型具有不同的測試性能。對于拉曼光譜在流加分批細胞培養(yǎng)VCD預測中的應用，Nicholas在驗證集中獲得了14.5%的最佳RMSE，其中3批用于模型訓練。Aditya對VCD模型進行了實時校正，得到了較好的結果，這意味著模型是基于一個大數(shù)據(jù)集進行訓練的，在驗證集中得到了1.3%的RMSE。對于模型訓練數(shù)據(jù)有限的灌流細胞培養(yǎng)，本研究的最佳VCD模型RMSEP為4.20×106個活細胞/mL，相對RMSEP為8.3%，說明我們的VCD模型是準確的。
值得注意的是，對拉曼光譜進行二階導數(shù)預處理的PLS模型預測的RMSE均低于一階導數(shù)，一階導數(shù)的預測VCD均被高估，說明在我們的情況下，拉曼光譜的一階導數(shù)會引入建模偏差。此外，二階導數(shù)消除了這一偏差，但方差隨著預測VCD的波動而增大。
另外，數(shù)據(jù)源對VCD的預選性能也有一定的影響。FC0A和FC0B是兩個具有相同起始點(接種密度、DO設定點、pH策略、溫度設定)的批次。然而，這種差異隨著時間的推移而增加，例如從第22天到第30天，由于乳酸的積累，F(xiàn)C0A的pH值從7.1降至6.8，但FC0B的pH值保持在7.1左右的穩(wěn)定(圖S1)。如果用FC0B訓練模型，兩批之間的差異會導致VCD的預測性能變差。因此，歷史數(shù)據(jù)比另一批(FC0B)的數(shù)據(jù)要好得多，考慮到早期灌細胞培養(yǎng)過程發(fā)展階段的批間差異是合理的。此外，圖8的結果還表明，將FC0B中的數(shù)據(jù)放入FC0A生成的訓練數(shù)據(jù)集中并沒有提高性能。
3.4. VCD的自動控制
如前所述，使用FC0A數(shù)據(jù)的二階導數(shù)模型或使用FC0A和FC0B數(shù)據(jù)訓練的二階導數(shù)模型具有相當?shù)念A測性能。所以我們選擇了具有FC0A數(shù)據(jù)的二階導數(shù)模型，我們假設歷史數(shù)據(jù)本身不會給VCD模型帶來額外的偏差。
如圖9所示，該圖顯示了我們?nèi)绾卧诠嗔骷毎囵B(yǎng)系統(tǒng)中實現(xiàn)自動排放。首先，將培養(yǎng)基連續(xù)注入生物反應器，在ATF細胞保留系統(tǒng)的幫助下連續(xù)收獲產(chǎn)品。在VCD的自動控制之前，細胞以恒定的泵速從生物反應器中排出，需要定期修改。拉曼光譜可以預測代謝物和VCD，并通過OPC連接將值傳遞給deltaV控制器。在deltaV控制器中，細胞放氣泵的設定值被級聯(lián)到VCD模塊的PID輸出。如圖10所示，兩種將泵級聯(lián)到VCD PID輸出的一般方法被應用于VCD自動控制。1) 從第51天到第56天，泵的速率被限制在10~20 g/h，以確保過程的穩(wěn)健，因此泵的工作就像“啟動”和“打開”狀態(tài)之間的開關。2) 在第56天之后，在deltaV系統(tǒng)的幫助下應用另一個VCD自動控制策略，VCD PID輸出根據(jù)泵速率使用以下等式進行縮放：圖片，其中泵速(g/h)是指泵的排放速率，PID輸出(0-100)是指通過OPC連接從拉曼分析儀傳輸?shù)絛eltaV系統(tǒng)的在線VCD信號的PID輸出。這樣，最大排放速率應在0.48VVD左右，并假定該控制回路對在線VCD的變化更為敏感。VCD的自動控制結果如圖10所示，目標VCD被設置為50× 106細胞/mL，這是灌流細胞培養(yǎng)的常見設置。與紅色填充圓相比，藍線指示的預測VCD值是可接受的。而且，預測值圍繞目標VCD波動，即50× 106個活細胞/mL。一旦在線預測VCD高于50× 106個細胞/mL，泵將如上所述開始工作。在P.I.D控制策略的幫助下，當更新的VCD降低到目標VCD時，泵速逐漸減小到0。如圖10所示，很明顯離線VCD在目標VCD周圍具有更高的振幅，這表明未來的工作需要更多的優(yōu)化。此外，從第51天到第56天，第一種VCD控制算法運行良好，從第56天到第62天，采用第二種VCD控制方法，在線VCD和離線VCD都在目標VCD附近波動，除了一個異常值。第59天的異常值應歸因于VCD測量誤差。因此VCD控制算法從第51天到第62天有效地工作。
表2中的結果還顯示，從第51天到第62天，在線和離線的受控VCD值的標準偏差分別為1.76和2.67，這與圖10中的趨勢一致。在線VCD和離線VCD預測值的平均值都穩(wěn)定地保持在目標VCD，分別為50.98× 106個活細胞/mL和50.67× 106個活細胞/mL。因此，本研究成功地開發(fā)出一套可行的哺乳動物細胞培養(yǎng)液灌流VCD自動控制策略。
4. 結論
此次研究建立了灌流細胞培養(yǎng)-拉曼集成系統(tǒng)，實現(xiàn)了關鍵代謝物的在線監(jiān)測和活細胞密度的自動控制。與生物量探針、pCO2探針、葡萄糖/乳酸探針等細胞培養(yǎng)過程中的PAT技術相比，多功能PAT技術在降低操作復雜度的同時，具有更大的應用前景。結果表明，用一批剛校準的模型，RMSEP分別為0.71g/L、0.24g/L、5mosmo/kg和147.48mg/L，可準確預測葡萄糖、乳酸、滲透壓和IgG濃度。另外，谷氨酸、谷氨酰胺、pCO2、Na+和K+等參數(shù)的預測精度也可以接受。
結果還表明，對拉曼光譜進行二階導數(shù)預處理比一階導數(shù)具有更好的VCD預測性能，批次本身的歷史數(shù)據(jù)比平行批次的VCD建模和標定性能更好，這意味著對模型輸入變量進行細致的統(tǒng)計篩選以及數(shù)據(jù)預處理方法對模型性能有著重要的影響。提出了一種可行的灌流哺乳動物細胞培養(yǎng)VCD的自動控制策略，即在線和離線VCD保持在目標VCD為50×106個活細胞/mL，即對應11天分別為50.98±1.76個活細胞/mL和50.67 ±2.67個活細胞/mL。這些工作為PAT在生物制品連續(xù)生產(chǎn)中的應用奠定了堅實的基礎，顯示了實時調(diào)節(jié)產(chǎn)品質(zhì)量的巨大潛力，為解決生物制品連續(xù)生產(chǎn)中的質(zhì)量問題提供了穩(wěn)健的工具。
